Cuantificación Espectrofotométrica de Proteínas

El procedimiento de cuantificación espectrofotométrica de proteínas, está basado en el método diseñado por Bradford (1976).

Se prepara una solución estándar de albúmina, conteniendo 10 mg disueltos en 10 ml de NaCl 0.15 M. La concentración de albúmina en la solución se comprueba con un análisis espectrofotométrico a 278 nm, en el espectro UV; la absorbancia a esta longitud de onda, debe ser de 0.66, si este dato no se obtiene es necesario ajustar la concentración.
Las soluciones conteniendo de 10 a 100 µg de estándar de albúmina, se pipetean en tubos de 12 x 100 mm y en un volumen de 0.1 ml. El volumen en el tubo de prueba también se ajusta a 0.1 ml con solución de NaCl 0.15 M.
Se le agregan 5 ml de reactivo, el cual se prepara de la siguiente forma: se disuelven 100 mg de azul brillante de Coomasie G-250 en 50 ml de etanol al 95%. A esta solución se le agregan 100 ml de ácido fosfórico al 85% (p/v), la solución resultante se diluye a un volumen final de 1 litro.
Se dibuja una gráfica patrón de proteínas: cantidad de albúmina (eje de las abscisas) contra absorbancia obtenida a una longitud de onda de 595 nm (eje de las ordenadas).
La solución problema se diluye con NaCl 0.15 M. Se pipetea en cada tubo un volumen de 0.1 ml de la solución problema en tubos de 12 x 100 mm, se le agregan 5 ml de reactivo y se lee a una longitud de onda de 595 nm. Se prepara un blanco que contenga 0.1 ml de NaCl 0.15 M más 5 ml de reactivo.
La absorbancia resultante del problema se interpola a la curva patrón y se extrapola de esta al eje de las X para conocer la cantidad de proteína contenida en la muestra.

Bradford, M.M. (1976)A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein Dye Binding. Analytical Biochem 72: 248-254

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